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SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术|真固生物出席2018第

字号+ 作者:基因谷 来源:未知 2018-04-03 14:11 我要评论( )

SLIMamp 基于多重PCR的靶向文库制备技术 | 真固生物出席2018第五届NGS创新开发者大会 2018年3月31日-4月1

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术|真固生物出席2018第五届NGS创新开发者大会

2018年3月31日-4月1日,真固生物应邀参加在南京瑞斯丽酒店举办的“2018第五届NGS创新开发者大会”。在大会上,真固生物研发总监肖建锋博士盛情分享真固生物独有的基于多重PCR靶向NGS文库制备技术——茎环阻遏介导的扩增方法(Stem-LoopInhibitionMediatedamplification,SLIMamp)。

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

图1.肖建峰博士在大会分享“SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术”

肖博士认为“通过多重PCR靶向构建NGS文库需要解决目标区域重叠区域和引物二聚体对于目标区域的影响”,并针对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本 (Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE) 制备文库提出解决方案。

多重PCR对于重叠区域的处理

对于较长目标区域,例如BRCA1/2基因全外显子测序,在进行多重PCR靶向文库制备时为了完全覆盖目标区域,相邻的目标区域必须部分重叠。由于重叠区域的短扩增子扩增效率较高,会极大抑制目标区域的扩增,影响目标区域产物。因此通常解决这个问题是采用将文库分成不同pool进行,避免重叠区域的影响,但这样会造成整个反应体系复杂,实验操作繁琐,而且对于样本的消耗较大,特别是对于活检和血液样本,直接影响其检测灵敏度。因此真固生物尝试在一管体系中完成NGS文库制备。

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

图2.重叠区域的影响

SLIMamp技术构建文库流程比较简单,通过两步PCR和两步纯化得到目标区域的文库。其中第一步PCR是引物(含Tag)与目标区域结合,第二步PCR是连接测序接头,使得构建的文库可以用于上机测序。SLIMamp技术通过独特的引物设计,使得重叠区域扩增子形成一个茎环结构,同时提高第二步PCR过程中的退火温度,进一步抑制重叠区域扩增子的产生。真固生物通过这种技术成功研制出了针对BRCA1/2基因全外显子测序的建库试剂盒。2016年,真固生物美国母公司Pillar Biosciences应用抑制目标区域重叠区域扩增方法构建NGS文库申请了专利——“Selective Amplification of Overlapping Amplicons”(专利公开号:WO 2016/144619 A1)。

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

图3.重叠区域扩增子选择性扩增方法

多重PCR对于引物二聚体的处理

在多重PCR建库过程中会使用到上百甚至上千对的引物,尤其是在反应初期引物的浓度较高,即使不同的引物的末端存在少数配对碱基,也会使得引物间产生不可忽视的引物二聚体。真固生物通过专利设计独特的引物,使得引物间产生的二聚体受到抑制,避免对目标区域扩增子造成影响。2017年,中国知识产权局和美国专利及商标局授权公布了真固生物通过减少引物二聚体方法制备NGS文库专利——“Method for Reducing Primer-DimerAmplification”(专利授权号:US 9605305B2,ZL 2016 8 0001111.1)。

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

图4.减少引物二聚体扩增的方法

FFPE样本建库处理

多重PCR靶向NGS文库构建在解决了重叠区域的一管扩增和引物二聚体的问题后,对于一般性质量较好的组织样本文库制备都可获得较高质量的文库。但是,由于FFPE样品的DNA容易发生严重的降解、损伤,所以对此类样本建库提出更高的要求。真固生物通过独特的引物设计、原材料优选、反应体系优化和临床样本验证等流程,使得在针对严重降解的FFPE样本建库都有较高的质量。

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

图5.FFPE样本建库一般性建议

PiVAT智能化生物信息分析

真固生物自主设计了一套智能化生物信息分析系统(PiVAT),并针对不同的Panel配套相应的分析模块,通过Web界面一步操作实现测序数据从fastq文件到突变列表的全部工作。PiVAT具有独创的生物信息学算法并持续不断更新优化,能够显著提高测序的灵敏度和特异性。在重度降解的FFPE和血浆样本中通过质量分数重新校正、局部重新比对和背景噪音的过滤提高突变检测的灵敏度和可靠性。

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图6.PiVAT

2018第五届NGS创新开发者大会

2018第五届NGS创新开发者大会以“价值创造”为主题,汇聚了业内三百多位技术大咖和行业精英,共同探讨NGS的技术基础研发、未来发展以及临床应用。

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

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图7.2018第五届NGS创新开发者大会

真固生物作为NGS领域拥有两项多重PCR靶向建库专利技术的拥有者,为临床实验室提供简便、快速、高效的Panel用于指导临床治疗。2018年3月,真固生物与全球最大的测序平台提供商Illumina达成战略合作,进一步确立了真固生物在整个NGS市场上的作用和地位。真固生物建库平台具有较强的兼容性(个性化定制Panel)和开放性(支持IVD的CRO+CMO合作模式)。本次真固生物受组委会邀请参加2018第五届NGS创新开发者大会,在5号展台与业界各位大咖和专家同道一起交流,共同努力推进NGS的发展。

SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术

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图8.真固生物5号展台

关于真固生物

真固生物是一家专业从事临床精准诊断产品开发和服务的公司,通过提供基于NGS的检测试剂和生物信息分析软件解决方案使得临床NGS操作更便捷、性价比更高。真固生物期望向NGS医学检测实验室持续提供更丰富更高质量更优性价比的产品从而协同伙伴创造价值。欲了解更多,请登录http://www.zg-bio.com/或关注微信“上海真固生物科技有限公司”。

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